Олигомеризация биомиметических УФ-фильтров для солнцезащитных средств нового поколения

Зачем понадобилось это исследование

Растения защищаются от избытка ультрафиолетового излучения, накапливая в наружных частях фенольные соединения, которые называют УФ-фильтрами. Для человека ультрафиолет опасен: он вызывает меланомы и фотостарение. Собственный ответ организма, образование меланина (загар), развивается с задержкой и поэтому не предотвращает первичное УФ-повреждение, что и делает необходимым нанесение солнцезащитных средств.

Природный УФ-фильтр пара-кумаровая кислота (pCA) - вторичный метаболит растений, который находится в кутикуле плодов томата и синтезируется по фенилпропаноидному пути. Её защитные свойства на поверхности растительных клеток хорошо изучены. Максимум поглощения pCA лежит в области UVB (280-315 нм), в этаноле он равен 312 нм. После УФ-возбуждения в растворе энергия рассеивается безызлучательно через координату транс-цис изомеризации и коническое пересечение, где двугранный угол двойной связи составляет 90,3°, что позволяет молекуле остыть до транс- или цис-геометрии основного состояния.

Авторы отмечают недостатки искусственных УФ-фильтров, применяемых в солнцезащитных составах: низкую светостабильность, нежелательную фотохимию при длительном облучении, недостаточное покрытие UVA (315-400 нм) и разнообразные опасения по безопасности. Фитохимические и биомиметические фильтры часто разрушаются меньше и лучше ослабляют UVA, но обычно это небольшие молекулы. Они не удовлетворяют так называемому правилу 500 дальтон, по которому вероятность чрескожного проникновения минимальна, если масса наносимой на кожу молекулы составляет 500 Да и более.

Цель работы - изучить олигомеризацию биомиметических фильтров как принцип проектирования. Для этого синтезировали тример pCA (3pCA, 456,45 Да, мономер - 164,16 Да), который ближе к порогу в 500 Да и потенциально обладает более широким поглощением со сдвигом в красную область. Авторы исследовали его стационарной и сверхбыстрой переходной абсорбционной спектроскопией.

Как проводили

Это химическое и спектроскопическое исследование, в нём не участвовали люди, животные, кожа или клеточные культуры. Тример получали многостадийным синтезом из коммерчески доступной pCA: защита фенольной группы, активация карбоксильной группы, этерификация с получением димера, затем деблокирование и повторная этерификация, после чего были сняты все защитные группы. Тример получен с чистотой выше 95% и подтверждён как полностью транс-изомер. Попытка синтезировать пентамер не удалась из-за проблем с растворимостью.

Стационарные спектры поглощения в метаноле регистрировали в кварцевой кювете 1 см на спектрометре Cary 60. Для облучения использовали имитатор солнечного света Oriel LCS-100 с фильтром спектра AM 1.5G при интенсивности, эквивалентной одному «солнцу» (около 1000 Вт на кв. м). Скорости образования фотостационарных состояний определяли глобальной последовательной подгонкой в программе Glotaran. Эмиссионный спектр снимали при возбуждении 315 нм и максимальной оптической плотности 0,15.

Для сверхбыстрой переходной абсорбционной спектроскопии использовали титан-сапфировую лазерную систему, 315-нм импульс накачки получали оптическим параметрическим усилителем, а зондирующим служил белый суперконтинуум 320-740 нм. Задержки между накачкой и зондированием составляли от -1 пс до 1,9 нс, концентрация 3pCA в метаноле - 65 мкМ, раствор прокачивали через проточную ячейку с оптическим путём 950 мкм. Функция отклика прибора оценена в 110 фс.

Расчётную часть выполняли в два шага: конформационный поиск (CREST, метод GFN2-xTB), затем оптимизация геометрии основного состояния и расчёт вертикальных возбуждений методами DFT и TD-DFT (функционал B3LYP, базис def2-TZVP, дисперсионная поправка D3, неявная модель метанола CPCM). Все эксперименты проводили в метаноле, так как 3pCA плохо растворим или нерастворим в воде, циклогексане, хлороформе, диэтиловом эфире, ацетонитриле и тетрагидрофуране, а в диметилсульфоксиде (ДМСО) растворяется, но растворитель может вызывать нежелательную фотохимию. Близкий профиль поглощения в метаноле и ДМСО, по мнению авторов, говорит об отсутствии значимых межмолекулярных электронных взаимодействий в агрегатах.

Что получилось

До облучения 3pCA в метаноле имеет максимум поглощения 315 нм, на границе областей UVA и UVB, с молярным коэффициентом экстинкции 42 700 М-1 см-1. По сравнению с мономером поглощение тримера смещено в красную область (на 5 нм), шире и по пиковому значению более чем вдвое выше. Авторы считают это желательным для солнцезащитных составов. Умеренный сдвиг при резком росте поглощения указывает, что тример ведёт себя как три в основном независимых pCA-подобных хромофора без дополнительного расширения сопряжения. Увеличение поглощения не достигает ожидаемого трёхкратного, что объясняется неравноценным вкладом хромофоров, поскольку у них различаются соединяющие группы; расчёты TD-DFT подтвердили различия в энергиях возбуждения и силах осцилляторов.

При облучении имитатором солнечного света в течение 24 часов в спектрах наблюдались изменения, соответствующие нескольким процессам фотоизомеризации и образованию нескольких фотостационарных состояний. Подгонка выявила четыре константы скорости: k1 = 1,60 x 10-1 с-1, k2 = 2,65 x 10-3 с-1, k3 = 4,56 x 10-4 с-1 и k4 = 1,23 x 10-5 с-1. Три быстрых процесса приписаны образованию транс-цис фотостационарных состояний трёх разных хромофоров, а самый медленный (k4) отнесён к деградации, так как при нём снижалось поглощение во всей УФ-области без образования нового состояния. Различия скоростей составили 5,8 раза (k2 к k3), 60 раз (k1 к k2) и 350 раз (k1 к k3). Авторы допускают, что сечения поглощения и их соотношения у хромофоров могут различаться, но, по их мнению, это вряд ли объяснит столь большие расхождения.

Индекс площади под кривой (AUCI, площадь после облучения к исходной в процентах) упал до 60% в области UVA и UVB в течение первых 2 часов, в основном из-за фотоизомеризации и образования трёх фотостационарных состояний. Ранее применявшийся критерий фотостабильности требует AUCI выше 80% после 2 часов облучения, но авторы указывают, что он не учитывает фотохимию, сохраняющую молекулу, но снижающую поглощение, как это делает изомеризация. Если начинать с уже образовавшейся смеси изомеров третьего фотостационарного состояния, то дальнейшее падение ещё на 10% (до AUCI 50%) занимает в сумме 16,5 часа облучения. Поскольку основная потеря поглощения связана с изомеризацией, а не с утратой целостности молекулы, авторы делают вывод о фотостабильности 3pCA. Оценить долю изомеризации методом ЯМР в дейтерированном метаноле не удалось из-за плохой растворимости.

Переходная абсорбционная спектроскопия после возбуждения на 315 нм показала за первые 10 пс три основных признака: отрицательный сигнал около 325 нм (обесцвечивание основного состояния), отрицательный сигнал с центром 440 нм (вынужденное излучение) и положительные сигналы около 360 нм и в области 500-740 нм (поглощение из возбуждённого состояния). После их затухания оставались долгоживущие сигналы (отрицательный на 335 нм и положительный на 375 нм), сохранявшиеся до конца окна измерения в 1,9 нс. Эти сигналы хорошо совпали с разностным спектром поглощения до и после облучения имитатором солнца, из чего авторы заключают, что долговременные фотохимические изменения (фотоизомеризация) происходят в пикосекундной шкале времени. Более длительное облучение (600 и 7200 с) лучше соответствовало спектру на 1,9 нс, что, по их мнению, говорит о параллельном возбуждении нескольких хромофоров.

Глобальный анализ дал времена жизни τ1 = 110 ± 55 фс, τ2 = 1,70 ± 0,05 пс и τ3 более 1,9 нс. Первое отнесено к быстрой релаксации геометрии в возбуждённом состоянии в направлении конического пересечения, второе - к внутренней конверсии через пересечение и заселению основного состояния, а третье отражает образование изомерного продукта. Квантовый выход излучения оказался ниже 1%, что согласуется с эффективным безызлучательным распадом. Сравнение с pCA показывает, что олигомеризация приводит к минимальным возмущениям возбуждённых состояний и сохраняет механизм безызлучательного распада. Авторы называют это неожиданным, поскольку дополнительный объём соседних звеньев мог бы ограничивать движения ядер при изомеризации.

Предварительное динамическое светорассеяние подтвердило в метаноле наночастицы размером около 100 нм, которые, по ссылкам авторов, оптимальны для рассеяния UVA и UVB.

Безопасность

Безопасность тримера в этой работе не изучалась: нет данных о токсичности, раздражающем или сенсибилизирующем действии, всасывании через кожу, эндокринной активности или воздействии на окружающую среду. Заключение о том, что увеличенная молекулярная масса может снизить проникновение через кожу, основано исключительно на правиле 500 Да, причём масса 3pCA (456,45 Да) всё же ниже этого порога, то есть формально он «ближе к соответствию», но не удовлетворяет ему. Экспериментальной проверки проникновения не проводили. Фотостабильность оценивали в растворе метанола при облучении 24 часа, в самом тексте она не сопоставлена с коммерческими фильтрами в одинаковых условиях.

Как авторы объясняют результаты

По мнению авторов, три хромофорных звена в молекуле работают в значительной степени независимо, и каждое использует изомеризуемую двойную связь, чтобы быстро рассеять поглощённую энергию в виде тепла без значимой деградации. Поэтому тример наследует желательные фотодинамические свойства мономера, а повышенная молярная поглощательная способность и расширение спектра добавляют преимуществ.

Низкую растворимость в большинстве органических растворителей авторы считают не недостатком, а возможным преимуществом: плохо растворимые частицы могут рассеивать УФ-свет, как это делают неорганические фильтры (оксид цинка, диоксид титана) и коммерческие наночастичные органические фильтры. Пример из текста - метилен-бис-бензотриазолил тетраметилбутилфенол (MBBT), у которого растворимость в воде ниже 10-6%, в большинстве косметических масел ниже 0,2%, и который микронизируют до наночастиц менее 200 нм для получения стабильной суспензии в составе.

В заключении авторы утверждают, что олигомеризация может служить эффективной стратегией проектирования биомиметических УФ-фильтров и применима к более широкому кругу фотоизомеризуемых хромофоров, вдохновлённых природными веществами, включая синапаты, флавоноиды и уроканаты. Они полагают, что систематическое сравнение мономера с последовательным добавлением по одному звену было бы полезно для понимания фотофизики олигомеров. Все эти выводы остаются предположениями, так как работа ограничена одним веществом в одном растворителе.

Ограничения

Исследование выполнено исключительно in vitro, на молекулярном уровне, в растворе метанола. Метанол выбран, чтобы воспроизвести ранее изученную полярную протонную среду и избежать фотохимии растворителя, но он существенно отличается от среды кожи и от готового солнцезащитного состава. Не оценивались ни SPF, ни UVA-защита, ни поведение вещества на коже, ни совместимость с другими компонентами, ни влияние на пигментацию или фотостарение. Утверждение о светорассеянии основано на предварительных измерениях в метаноле и на низкой растворимости, а не на измерении рассеяния в составе или на коже. Не удалось подтвердить степень изомеризации методом ЯМР, а синтез пентамера не удался из-за растворимости. Оценка скоростей по отдельным хромофорам опирается на допущения о равенстве сечений поглощения. Использованный критерий фотостабильности (AUCI выше 80% за 2 часа) 3pCA не выполняет, и вывод о его фотостабильности авторы делают на основании своих рассуждений об изомеризации. Конфликта интересов авторы не заявили; работа финансирована исследовательскими грантами, указанными в благодарностях.

Что взять в практику

Для практикующего косметолога эта статья имеет ознакомительное значение. Описанное вещество, тример пара-кумаровой кислоты, является лабораторной разработкой, его нет в солнцезащитных средствах, и клинических данных по нему нет. Результаты доклинические: они получены в растворе, а не на коже, поэтому их нельзя интерпретировать как свидетельство эффективности или безопасности для пациентов.

Работа полезна как иллюстрация того, какие свойства считают важными у новых УФ-фильтров: широкое поглощение в областях UVB и UVA, светостабильность, низкое проникновение через кожу и возможность светорассеяния. Пока эти предположения не проверены на коже и в готовых составах, никаких обещаний пациенту на их основании давать нельзя, а выбор солнцезащитного средства следует строить на данных о зарегистрированных продуктах.

Термины

Правило 500 дальтон

эмпирическое правило: вероятность чрескожного проникновения наносимой на кожу молекулы минимальна при молекулярной массе 500 Да и более

Фотостационарное состояние (PSS)

равновесная смесь транс- и цис-изомеров, устанавливающаяся при постоянном облучении

AUCI (индекс площади под кривой)

отношение площади под спектром поглощения после облучения к исходной, в процентах; применяется для оценки фотостабильности

Переходная абсорбционная спектроскопия

метод, регистрирующий изменения поглощения после короткого лазерного импульса с разрешением до фемтосекунд; позволяет определить времена жизни возбуждённых состояний