Рекомбинантный и нативный ботулотоксин типа A: сравнение структуры и фармакодинамики

Зачем понадобилось это исследование

Ботулинические нейротоксины (BoNT) - белки, которые вырабатывает Clostridium botulinum и родственные виды. Известны семь классических серотипов (BoNT/A-BoNT/G) и недавно описанный BoNT/X, а генетическое разнообразие делит их более чем на 40 подтипов. Несмотря на высокую токсичность, в клинической и эстетической медицине широко используют BoNT/A1 и BoNT/B1. Типичное эстетическое показание - межбровные морщины. Управление по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA) одобрило BoNT/A для клинического применения в 1989 году, а показание по межбровным морщинам утвердило в 2002 году. В Китае для этого показания зарегистрированы Botox (Allergan), Dysport (Ipsen), Xeomin (Merz), Letybo (Hugel), Hengli (Lanzhou Biological), Daxxify (Revance) и Hutox (Huons).

Все выпускаемые терапевтические препараты BoNT/A получают из нативного токсина, выделенного из культур C. botulinum. Патогенность продуцента и токсигенные свойства требуют жёстких мер биобезопасности, что, по словам авторов, усложняет производство, повышает его стоимость и энергозатраты. Кроме того, в клостридиальной культуре токсин образует комплекс со вспомогательными белками, точный тип и стехиометрия которых остаются неясными, а активация токсина идёт собственными ферментами бактерии, которые трудно контролировать.

Препарат YY001 (в заключении назван Retoxin) одобрен Национальным управлением медицинских продуктов Китая (NMPA) и, по утверждению авторов, стал первым зарегистрированным рекомбинантным BoNT/A в мире. Его создали, оптимизировав последовательности лёгкой (LC) и тяжёлой (HC) цепей нативного токсина и заменив природный линкер между цепями на сайт распознавания протеазы HRV-3C. Эта протеаза при очистке расщепляет сайт и имитирует природную активацию: одноцепочечный белок превращается в двухцепочечную молекулу, цепи которой связаны дисульфидной связью. Кодирующие последовательности LC и HC совпадают с нативными, но для функции токсина важнее третичная структура. Поэтому авторы решили впервые определить структуру активного рекомбинантного токсина и сравнить её с нативной, а затем проверить активность на животных.

Как получали и исследовали токсин

Рекомбинантный BoNT/A произвела компания Claruvis Pharmaceuticals (Чунцин). Ген BoNT/A1 клонировали в вектор pGex с GST-меткой на N-конце; два пептидных линкера с сайтом расщепления HRV-3C вставили между LC и HC и между GST-меткой и LC. Белок экспрессировали в клетках E. coli BL21 Star (DE3). Культуру выращивали в биореакторе в среде Terrific Broth при 37 °C, при достижении OD600 10 охлаждали до 18 °C, индуцировали 2 мМ IPTG и собирали через 50 часов. Клетки разрушали гомогенизацией под высоким давлением (1000 бар).

Очистка включала аффинную хроматографию на глутатионовой колонке с расщеплением протеазой 3C прямо на колонке (30 часов), затем катионообменную хроматографию на колонке HiTrap SP Fast Flow и гель-фильтрацию на колонке Chromdex 200 PG. Готовую субстанцию получали в концентрации 0,3 мг/мл в фосфатно-солевом буфере с 0,1% полисорбата 80 (pH 7,2) и хранили ниже -60 °C.

Чистоту и состав оценивали капиллярным электрофорезом с додецилсульфатом натрия (CE-SDS) в невосстанавливающих и восстанавливающих условиях и эксклюзионной ВЭЖХ (SEC-HPLC). Последовательность проверяли пептидным картированием с масс-спектрометрией: образцы расщепляли трипсином с Lys-C и отдельно химотрипсином, пептиды разделяли обращённо-фазовой УВЭЖХ и анализировали на масс-спектрометре Q Exactive H-FX, сопоставляя с теоретической последовательностью YY001.

Структуру определяли методом криоэлектронной микроскопии (cryo-EM) на микроскопе Titan Krios при 300 кВ. Из 3001 микрофотографии автоматически выбрали 3 836 864 частиц; после двух раундов 3D-классификации и уточнения итоговая реконструкция построена по 237 907 частицам. Атомную модель строили в Coot, взяв за шаблон нативный BoNT/A (запись PDB 3bta). Модель включила остатки 7-437 лёгкой цепи и 5-39, 45-175 и 181-850 тяжёлой цепи, что составило 97,6% длины белка.

Фармакодинамику сравнивали с Botox двумя методами. В тесте отведения пальцев (digit abduction score, DAS) 110 самцов мышей CD-1 случайно разделили на 11 групп по десять животных; им однократно вводили внутримышечно 10 мкл YY001, Botox или контроль (физиологический раствор с 0,5% человеческого альбумина). Дозы были маскированы директором исследования. Оценку проводили через 4, 8, 12 и 24 часа, затем каждые 12 часов до 72 часов, каждые 24 часа до 360 часов и каждые 72 часа до 720 часов. В модели CMAP самцам крыс Sprague-Dawley (n=3 на группу, масса 300 ± 20 г) однократно вводили YY001 или Botox в икроножную мышцу в дозе 0,1 ЕД на крысу; потенциал действия мышцы регистрировали при стимуляции седалищного нерва исходно и на 1, 6, 13, 27, 42 и 56 сутки. Активность YY001 определяли в стандартном мышином биотесте по LD50 (1 ЕД - доза, вызывающая гибель 50% животных при внутрибрюшинном введении), с наблюдением 96 часов.

Что получилось: состав, чистота и структура

Общая идентичность последовательности рекомбинантной конструкции с нативным токсином достигает 98,6%. Отличия составляют пять дополнительных остатков на N-конце лёгкой цепи, шесть отличающихся остатков на её C-конце и два на N-конце тяжёлой цепи; ключевые каталитические и функциональные остатки сохранены. Эти остатки остаются после отщепления протеазой. Пептидное картирование подтвердило, что основная последовательность соответствует заданной.

При CE-SDS в невосстанавливающих условиях преобладала интактная форма около 150 кДа, а в восстанавливающих выделялись два основных пика около 100 кДа (HC) и около 50 кДа (LC), которые вместе составили 99,07%. Это говорит о почти полном переходе одноцепочечного предшественника в активную двухцепочечную форму, как у нативного токсина. Чистота по SEC-HPLC составила 99,49%.

Разрешение карты плотности - 3,2 Å. Плотность лёгкой цепи хорошо определена, за исключением нескольких крупных гибких петель; покрытие около 96,2%. Домен трансмембранной транслокации (HN) тоже виден чётко, а рецепторсвязывающий домен (HC) выражен слабее. Авторы связывают это с подвижностью домена при связывании рецептора и транслокации и с умеренной предпочтительной ориентацией частиц. Модель тяжёлой цепи дополнили с помощью известных моделей высокого разрешения, покрытие около 98,7%. Метрики валидации оказались несколько хуже, чем обычно для такого разрешения, но, как у всех имеющихся структур BoNT, из-за гибкости белка; на интерпретацию общей конформации это, по мнению авторов, не влияет.

Рекомбинантный токсин имеет каноническую трёхдоменную архитектуру: каталитический домен (LC), домен транслокации (HN) и рецепторсвязывающий домен (HC). Домен HN образован парой удлинённых α-спиралей длиной около 105 Å. В его N-концевой области между Cys7 тяжёлой цепи и Cys435 лёгкой цепи образована дисульфидная связь, а петля примерно из 50 остатков охватывает каталитический домен, закрепляя сборку цепей.

Структура соответствует открытой конформации: между LC и HC нет прямого контакта, HC направлен к одному концу молекулы, а HN расположен вдоль оси вместе с LC. Для остальных серотипов такая топология тоже описана, например для BoNT/B в растворе, тогда как BoNT/E чаще принимает компактную закрытую форму, что может быть связано с его более быстрой транслокацией.

Среднеквадратичное отклонение (r.m.s.d.) при наложении на открытые структуры нативного BoNT/A составило 1,3-1,5 Å по 1257 атомам Cα. Для сравнения, наложения криоэлектронных и кристаллографических моделей BoNT/B и BoNT/E дают около 1,9 Å и около 2,0 Å. По отдельным доменам отклонения меньше: 0,8 Å для LC (431 Cα), 1,0 Å для HN (411 Cα) и 1,1 Å для HC (425 Cα). Это означает, что различия обусловлены относительным поворотом доменов, а не изменением их внутренней укладки: при совмещении по LC тяжёлая цепь рекомбинантного токсина повёрнута примерно на 2° по часовой стрелке, домен HN - тоже примерно на 2°.

В активном центре все элементы вторичной структуры сохранены, чётко различимы четыре гибкие петли вокруг активного центра и боковые цепи каталитических остатков. Однако плотность иона Zn2+ в мотиве HEXXH не обнаружена. Авторы называют возможные причины: отсутствие добавленного Zn2+ при очистке и неполное заполнение, ограниченную чувствительность метода к металлам в малой доле заполнения, возможную потерю металла при витрификации или под электронным пучком. Для определения координации металла нужны дополнительные подходы, например добавление Zn2+ при подготовке образца или данные более высокого разрешения.

Что получилось: фармакодинамика на животных

В тесте отведения пальцев у мышей рекомбинантный токсин подавлял сокращение мышцы уже через 4 часа после инъекции, максимум эффекта приходился на 24 часа, затем эффект постепенно ослабевал и к 720 часам возвращался к исходному уровню. При эквивалентных условиях дозирования восстановление после YY001 было несколько более длительным, чем после Botox. Наклоны кривых доза-эффект у двух препаратов значимо не различались; в статье приведены данные для группы с дозой 1,2 ЕД.

Авторы отдельно предупреждают, что прямое сравнение номинальных единиц между препаратами нужно трактовать осторожно. Кажущееся расхождение может быть связано с различиями в методах определения удельной активности разных препаратов ботулотоксина и с умеренной вариабельностью при серийных разведениях. Поскольку данные получены только на животных, перенос вывода о более длительном эффекте на человека нельзя считать обоснованным, нужны проспективные клинические исследования.

В модели CMAP на крысах однократная инъекция 0,33 ЕД/кг (0,1 ЕД на крысу) YY001 или Botox в икроножную мышцу дала сходные кривые подавления потенциала действия. На 6 и 13 сутки наблюдались преходящие различия, но оба препарата вызывали сопоставимое обратимое подавление, и значения возвращались к исходным к 27 суткам. Различия были небольшими и не сложились в устойчивое расхождение общего фармакодинамического профиля.

Авторы резюмируют, что в использованных моделях рекомбинантный и природный токсины фармакодинамически сопоставимы, с небольшими и преходящими различиями. Они подчёркивают, что выводы зависят от модели, использована одна доза в модели CMAP, а выборки малы; нужны исследования с несколькими дозами, временными точками и моделями.

Безопасность

Вопросы безопасности для человека в статье не изучались: нет ни клинических данных, ни токсикологических результатов, кроме описанных фармакодинамических экспериментов на животных. В выводах авторы говорят о потенциальных преимуществах рекомбинантной экспрессии для биобезопасности, стабильности партий и масштабируемости производства: не требуется культивировать патогенную клостридию, а активацию можно проводить контролируемой протеазой. Это утверждение о производстве, а не результат оценки безопасности препарата у пациентов.

Как авторы объясняют результаты

Авторы считают, что рекомбинантный токсин воспроизводит нативный остов и сохраняет подвижность доменов, которая позволяет принимать разные конформации в растворе: в двумерных классах наблюдается выраженная вариабельность положения HC. Небольшие локальные отклонения от нативных структур авторы частично относят к нефизиологическим конформерам, возникающим при кристаллической упаковке эталонных кристаллографических моделей.

Сходство активного центра и ключевых мотивов, по их мнению, объясняет сопоставимую активность в обеих моделях на животных. Более длительное восстановление у мышей они связывают скорее с методическими различиями (способ определения удельной активности и разведения), чем делают вывод о биологическом свойстве, и сами оговаривают, что для подтверждения нужны клинические исследования.

Ограничения

Работа структурная и доклиническая. В модели CMAP было по три крысы на группу и одна доза, в тесте DAS использовали только мышей. Данные о безопасности и эффективности у человека отсутствуют. Плотность Zn2+ в каталитическом центре не выявлена, рецепторсвязывающий домен виден хуже других, а метрики валидации структуры несколько хуже типичных для такого разрешения. Сопоставление единиц активности между препаратами имеет методические оговорки. Рекомбинантный токсин произведён компанией Claruvis Pharmaceuticals, структура определена в WuXi Biologics; раздела о финансировании и конфликте интересов в доступном тексте нет.

Что взять в практику

Для практикующего косметолога статья показывает, что рекомбинантный ботулотоксин типа A может быть структурно близок к нативному токсину и по фармакодинамике в экспериментах на мышах и крысах сопоставим с Botox. Это не клиническое исследование, поэтому оно не позволяет делать выводы об эффективности, длительности действия, дозах-эквивалентах или иммуногенности у пациентов.

Не стоит переносить результаты на животных на тактику работы с пациентами и обещать им конкретную продолжительность эффекта. Пересчёт единиц между разными препаратами ботулотоксина авторы сами считают источником неопределённости, поэтому ориентироваться нужно на инструкцию конкретного препарата и клинические данные по нему.

Термины

Рекомбинантный ботулотоксин

токсин, полученный в клетках другого организма (здесь E. coli) с помощью генной инженерии, а не выделенный из культуры C. botulinum

Криоэлектронная микроскопия (cryo-EM)

метод определения пространственной структуры белка по изображениям замороженных молекул, здесь с разрешением 3,2 Å

Среднеквадратичное отклонение (r.m.s.d.)

мера расхождения положения атомов при наложении двух структур; чем меньше, тем структуры ближе

Digit abduction score (DAS)

тест на мышах: оценка отведения пальцев задней лапы после введения токсина, отражает степень паралича мышцы

CMAP

суммарный потенциал действия мышцы при стимуляции нерва; его амплитуда отражает нервно-мышечную передачу