Ретинол стимулирует выработку факторов роста и маркеров внеклеточного матрикса в дермальных фибробластах человека

Зачем понадобилось это исследование

Кожа выполняет роль первичного защитного барьера от ультрафиолета, физических и химических повреждений и инфекций. Помимо подкожной жировой клетчатки, она состоит из эпидермиса, образованного преимущественно кератиноцитами, и дермы с фибробластами, белками (коллаген, эластин, фибронектин, протеогликаны) и гликозаминогликанами, такими как гиалуроновая кислота (ГК) и хондроитинсульфат. Белковые и углеводные структуры вместе составляют внеклеточный матрикс. Коллаген, около 90% сухой массы кожи, обеспечивает структурную стабильность и упругость дермы, а гликозаминогликаны связывают воду. При старении состав гликозаминогликанов меняется, вода удерживается хуже, и растяжимость кожи снижается.

Авторы различают хронологическое (внутреннее) и внешнее старение, в основном вызванное ультрафиолетом. Механизмы различаются, но молекулярные признаки общие: разрушение коллагеновых волокон из-за повышения активности матриксных металлопротеиназ, снижение синтеза коллагена из-за нарушенной передачи сигнала TGF-β и воспалительное микроокружение (inflammaging). Возрастные изменения дермы проявляются ломкостью, нарушенной поддержкой сосудов и ухудшением заживления ран.

Фибробласты и матрикс влияют друг на друга: фибробласты синтезируют и организуют матрикс, а состав и механика матрикса, в свою очередь, меняют фенотип фибробластов. Заживление раны включает три фазы. Во вторую, пролиферативную фазу, которая длится до пяти-семи дней после травмы, растут капилляры, образуется грануляционная ткань, пролиферируют фибробласты с синтезом коллагена. Факторы роста, прежде всего TGF-β, стимулируют миграцию и пролиферацию фибробластов; FGF-2 может запускать ангиогенез в первые три дня, а VEGF важен для ангиогенеза на 4-7 день. Третья фаза, созревание, может длиться до года.

Ретинол, производное витамина A, относится к ретиноидам и известен как средство против старения и для заживления ран. При нанесении на кожу он проникает в неё и последовательно превращается в ретиналь, а затем в ретиноевую кислоту, активный метаболит; она действует через ядерные рецепторы RAR и RXR. Авторы приводят данные о том, что ретинол улучшает видимые проявления старения (морщины, тонкие линии, неравномерную пигментацию), а топические ретиноиды увеличивают пролиферацию эндотелия и сосудов в сосочковом слое дермы. В исследованиях на животных они улучшали репарацию, а в исследовании на людях кратковременное нанесение третиноина на хронические язвы голени увеличивало образование грануляционной ткани. При этом клеточные и молекулярные механизмы не изучены полностью, по ретинолу данных меньше, чем по ретиноевой кислоте, а исследований на уровне белка очень мало. Цель работы - оценить на уровне белка влияние ретинола на основные факторы роста, анаболический фермент и главные структурные белки дермы в линии дермальных фибробластов человека.

Как проводили

Работа выполнена in vitro: использовали фибробласты человека линии CCD-1135Sk (ATCC CRL-2691), которые выращивали в среде IMDM с 15% фетальной бычьей сыворотки, 4 мМ L-глутамина и 1% пенициллина-стрептомицина при 37 °C и 5% CO2. Раствор транс-ретинола (95%) концентрацией 40 мМ каждый раз готовили заново в ДМСО, стерилизовали фильтром 0,22 мкм и защищали от света алюминиевой фольгой из-за светочувствительности ретинола; рабочие разведения делали в питательной среде непосредственно перед обработкой.

Чтобы выбрать концентрации, оценили жизнеспособность клеток тестом XTT при 0,01-10 мкМ через 24, 48 и 72 часа (с контролем растворителя), а пролиферацию - по включению BrdU при 0,01-1 мкМ через 24 и 48 часов. Для основных опытов выбрали 0,05 и 0,5 мкМ.

Для анализа факторов роста клетки (по 105 на лунку шестилуночных планшетов) выдерживали в среде с низким содержанием сыворотки и обрабатывали ретинолом 24 часа (VEGF, FGF-2, TGF-β). Гиалуронансинтазу 2 (HAS-2) определяли через 24 часа в стандартных условиях, а коллаген I (COL-I) и коллаген III (COL-III) - через 48 часов. По окончании инкубации собирали надосадочную жидкость, центрифугировали и хранили при -80 °C.

Концентрации белков измеряли иммуноферментным анализом (ИФА) с помощью наборов YL Biont (Шанхай); для нормализации образцов применяли набор на основе бицинхониновой кислоты (BCA). Все измерения проводили в трёх повторах. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение, различия оценивали t-критерием Стьюдента (p < 0,05 считали значимым) в программе OriginPro 10.2.5.

Что получилось

Жизнеспособность. Низкие концентрации ретинола (0,01-0,5 мкМ) мало влияли на жизнеспособность, которая оставалась сопоставимой с контролем и обычно выше 85%, а через 24 часа близкой к 100%. Концентрации от 1 мкМ снижали жизнеспособность в зависимости от дозы и времени: через 24 часа примерно до 76, 71, 68 и 65% при 1, 2, 5 и 10 мкМ, через 48 часов до 56, 50, 48 и 47%, через 72 часа до 49, 42, 30 и 18%. Растворитель на жизнеспособность не влиял.

Пролиферация. Концентрации до 0,5 мкМ поддерживали пролиферацию на уровне контроля, а 1 мкМ значимо снижал её до 77% через 24 часа и до 57% через 48 часов. Поэтому 0,05 мкМ авторы назвали эффективной «физиологической» дозой, а 0,5 мкМ - максимальной концентрацией, сохраняющей нормальную пролиферацию.

Факторы роста. VEGF вырос с примерно 600 нг/л в контроле до 795 нг/л при 0,05 мкМ и до 980 нг/л при 0,5 мкМ, оба раза p < 0,001. FGF-2 вырос с примерно 140 до 162 нг/л (p < 0,05) и 186 нг/л (p < 0,001). TGF-β вырос с примерно 1750 до 2000 нг/л (p < 0,05) и 2450 нг/л (p < 0,001).

Гиалуронансинтаза и коллагены. Уровень HAS-2 значимо повышался при обеих концентрациях (p < 0,001); числовые значения в тексте не приведены. COL-I вырос с примерно 11,5 нг/мл в контроле до 16,0 нг/мл и 19,9 нг/мл (оба раза p < 0,001). COL-III вырос с примерно 10,1 мкг/мл до 13,3 мкг/мл (p < 0,05) и 15,1 мкг/мл (p < 0,01). Таким образом, эффект на TGF-β, FGF-2 и COL-III зависел от дозы, а на VEGF, HAS-2 и COL-I был максимальным уже при низкой концентрации 0,05 мкМ, то есть не нарастал пропорционально дозе (по формулировке авторов, наивысшие значения наблюдались даже при низкой концентрации, что они сочли неожиданным).

Авторы резюмируют, что ретинол вызывает скоординированный регенеративный ответ фибробластов, выражающийся в усилении синтеза матрикса, ангиогенных сигналов, синтеза гиалуроновой кислоты и ремоделирования ткани. Эти выводы относятся к культуре клеток и основаны на сравнении с необработанным контролем.

Безопасность

Клиническую безопасность ретинола в этой работе не оценивали, так как исследование проводилось на клеточной линии. Единственные данные, косвенно относящиеся к переносимости, - это тесты цитотоксичности в культуре. Концентрации 0,5 мкМ и ниже в условиях эксперимента переносились в целом хорошо, а начиная с 1 мкМ жизнеспособность и пролиферация фибробластов снижались в зависимости от дозы и времени, причём через 72 часа при 10 мкМ жизнеспособность составила примерно 18% от контроля. Раздражение кожи, ретиноидный дерматит, фотосенсибилизация и иные нежелательные явления не изучались. Эти результаты нельзя переносить на кожу человека, так как барьер рогового слоя пропускает в живую дерму лишь часть нанесённого средства.

Как авторы объясняют результаты

Рост TGF-β авторы считают особенно важным, поскольку он один из главных стимуляторов активности фибробластов и синтеза матрикса: в нормальных дермальных фибробластах TGF-β повышает экспрессию COL-I, COL-III и фибронектина. По их мнению, индуцированное ретинолом повышение TGF-β может быть правдоподобным механизмом восстановления анаболической активности фибробластов в стареющей коже. В заживлении ран TGF-β стимулирует пролиферацию и миграцию фибробластов, дифференцировку миофибробластов, контракцию раны и отложение коллагена.

Увеличение VEGF указывает на возможное усиление ангиогенных сигналов. Ранее показано, что ретиноевая кислота повышает экспрессию VEGF в нормальных дермальных фибробластах через RAR-зависимые механизмы. Поскольку стареющая кожа менее васкуляризирована, а ангиогенез необходим для образования грануляционной ткани, рост VEGF может поддерживать оба вида эффектов. FGF-2 стимулирует пролиферацию фибробластов и активность эндотелия, действует совместно с VEGF, и одновременный рост обоих факторов, по мнению авторов, может указывать на формирование среды, благоприятной для васкуляризации.

Гиалуроновая кислота - основная водосвязывающая молекула матрикса. Старение сопровождается потерей и изменением распределения ГК, что ведёт к сухости, снижению тургора и эластичности, а при заживлении ГК облегчает миграцию фибробластов и кератиноцитов. По прежним данным, ретинол повышает экспрессию генов HAS и образование ГК в моделях кожи человека и в коже человека in vivo. Рост HAS-2, одного из главных ферментов синтеза ГК, говорит, по мнению авторов, что ретинол может усиливать гидратацию матрикса и миграцию фибробластов.

Одновременное повышение COL-I и COL-III авторы называют прямым свидетельством анаболической активности. COL-I даёт зрелой дерме прочность на разрыв, а COL-III образует более хрупкую и эластичную сеть, характерную для молодой соединительной ткани и раннего матрикса раны. Они приводят данные клинических работ, где ретинол повышал уровень проколлагена I (COL-I) и уменьшал мелкие морщины в естественно состаренной коже, и считают результаты согласующимися с ними. Для заживления ран авторы отмечают значимость баланса COL-I и COL-III, поскольку изменённое соотношение может быть связано с патологическим рубцеванием.

Выбор концентраций авторы обосновывают жизнеспособностью клеток и данными о чрескожной абсорбции топических ретиноидов. Концентрацию 0,05 мкМ они называют начальной эффективной концентрацией в косметических препаратах, а 0,5 мкМ - физиологическим стационарным уровнем в дерме после нанесения составов средней и высокой силы (0,5%). Отмечено, что рост жизнеспособности в первые 24 часа при 0,05-0,5 мкМ вероятно связан с усилением пролиферации. Также они подчёркивают, что ИФА подтверждает прохождение транскрипционных ответов, запущенных комплексом RAR/RXR, через посттранскрипционные и трансляционные этапы до секреции белков, и называют новизной работы связь клинических свойств ретинола с конкретными белковыми маркёрами.

Ограничения

Главное ограничение, названное самими авторами, - монокультура дермальных фибробластов, которая не воспроизводит сложность кожи, где динамично взаимодействуют кератиноциты, эндотелиальные и иммунные клетки и организованный матрикс. Они предлагают подтвердить данные в сокультурах или эквивалентах кожи. Дополнительно из текста видно: использована одна клеточная линия (CCD-1135Sk), две концентрации ретинола, эксперименты в трёх повторах с t-критерием Стьюдента без описания поправки на множественные сравнения; в тексте нет сравнения с ретиноевой кислотой или другими ретиноидами, нет анализа экспрессии генов и активации рецепторов RAR/RXR, а механизмы описаны предположительно. Числовые значения для многих показателей приведены как приблизительные (по графикам), для HAS-2 значения не приведены. Измерены уровни белков в супернатанте, а не функциональные исходы, такие как миграция фибробластов, образование сосудов, зрелость или структура коллагена. Утверждения о противовозрастном и ранозаживляющем действии являются экстраполяцией. В полученном тексте статьи разделов о финансировании и конфликте интересов нет, поэтому сведений о них привести нельзя.

Что взять в практику

Исследование доклиническое (in vitro, клеточная линия) и не оценивало ни морщины, ни толщину и плотность дермы, ни переносимость на коже, ни заживление ран у людей. Поэтому его результаты сами по себе не дают оснований делать выводы о клинической эффективности ретинола и тем более давать пациенту какие-либо обещания по омоложению или заживлению. Это лишь экспериментальное подтверждение биологической правдоподобности механизма: в изолированных фибробластах ретинол повышал уровни ангиогенных факторов, TGF-β, гиалуронансинтазы 2 и коллагенов I и III.

Практически полезны два наблюдения, которые подтверждаются текстом, но тоже ограничены культурой клеток. Во-первых, ответ достигался уже при 0,05 мкМ, и для VEGF, HAS-2 и COL-I не возрастал пропорционально дозе. Во-вторых, начиная с 1 мкМ жизнеспособность и пролиферация фибробластов снижались, то есть увеличение концентрации в этой модели не всегда означает лучший результат. Эти наблюдения не заменяют клинических данных, и выбор концентрации и режима ретиноидов для пациента нужно основывать на клинических исследованиях и инструкциях к конкретным средствам.

Термины

ИФА (иммуноферментный анализ)

метод количественного определения белков в жидкости с помощью антител; здесь использован для измерения VEGF, FGF-2, TGF-β, HAS-2, COL-I и COL-III в надосадочной жидкости культуры

HAS-2 (гиалуронансинтаза 2)

один из основных ферментов синтеза гиалуроновой кислоты, главной водосвязывающей молекулы внеклеточного матрикса

XTT-тест

колориметрический тест жизнеспособности клеток, основанный на метаболическом восстановлении тетразолиевого красителя

Монокультура

культура клеток одного типа без других клеток кожи; не воспроизводит взаимодействие кератиноцитов, сосудистых и иммунных клеток