Биостимуляторы на основе гидроксиапатита кальция: сравнительное исследование биологического ответа и морфологии частиц

Зачем понадобилось это исследование

Препараты на основе гидроксиапатита кальция относятся к биостимуляторам: их вводят не только ради объёма, но и чтобы запустить в коже синтез собственного коллагена. На рынке есть несколько таких продуктов, и по составу на бумаге они очень похожи: около 30% микросфер гидроксиапатита, гель-носитель из глицерина и карбоксиметилцеллюлозы, близкий заявленный размер частиц. Для врача естественно предположить, что и действуют они одинаково. Авторы из Бразилии решили проверить, так ли это.

Дерма в основном состоит из межклеточного матрикса: коллагена, эластических волокон и протеогликанов. Синтезируют и перестраивают его фибробласты, поэтому именно они служат главной мишенью биостимуляторов. Гидроксиапатит кальция представляет собой фосфатно-кальциевую биокерамику, хорошо изученную по биосовместимости, а предыдущие лабораторные и гистологические работы показывали, что он напрямую взаимодействует с фибробластами. Высказывалось предположение, что на этот ответ влияет форма частиц и рельеф их поверхности.

Прямых стандартизованных сравнений коммерческих продуктов с одинаковым заявленным составом почти нет. Цель работы состояла в том, чтобы выяснить, различаются ли два таких препарата по действию на фибробласты человека и по строению частиц и могут ли свойства материала, выходящие за рамки формального состава, объяснять различия в биологическом ответе.

Как проводили

Это лабораторное сравнительное исследование, а не клиническое: пациентов в нём не было. Использовали первичные фибробласты кожи одного здорового донора, полученные в рамках одобренного этическим комитетом протокола вторичного использования клеток. Клетки выращивали в стандартной среде DMEM с сывороткой при 37 °C и 5% CO2 и высевали по тысяче клеток на лунку.

Сравнивали два продукта. Образец R представлял собой Radiesse (Radiesse Duo, Merz North America), образец S представлял собой Stiim (CG Bio Co.). По данным производителей оба содержат около 30% гидроксиапатита кальция по объёму, частицы размером 25-45 мкм и гель-носитель из глицерина и натрия карбоксиметилцеллюлозы на воде для инъекций. Различались только условия хранения: 15-32 °C у образца R и 15-25 °C у образца S. Непосредственно перед опытом каждый продукт разводили в питательной среде до 10 мг/мл и добавляли по 100 мкл в лунку, контрольные лунки получали только среду. Все условия ставили в трёх повторах, воздействие длилось до 72 часов.

Метаболическую активность клеток оценивали МТТ-тестом через 24, 36, 48 и 72 часа: клетки инкубировали с реактивом, растворяли образовавшиеся кристаллы и измеряли поглощение при 570 нм, принимая контроль за 100%. Через 72 часа из клеток выделяли РНК и методом ПЦР в реальном времени оценивали экспрессию генов коллагена I типа и эластина относительно контроля, используя β-актин как внутренний стандарт. Отдельно микросферы отмывали от геля, высушивали и изучали в сканирующем электронном микроскопе при разных увеличениях, но только качественно, без измерения размеров. Группы сравнивали однофакторным дисперсионным анализом с поправкой Бонферрони.

Важно понимать масштаб такого эксперимента. Фибробласты в пластиковой лунке получают разведённый препарат в питательной среде, а не плотное депо геля в дерме, как при инъекции. Концентрация 10 мг/мл выбрана для удобства лабораторного сравнения и не соответствует реальной концентрации частиц вокруг клеток после введения. Поэтому эксперимент отвечает на вопрос о том, как клетки реагируют на контакт с частицами, но не о том, какой объём коллагена образуется у пациента.

Что получилось

Оба продукта повышали метаболическую активность фибробластов по сравнению с контролем во все четыре срока (p<0,001). Через 24 и 36 часов разница между ними была незначимой. Начиная с 48 часов образец S давал более выраженный эффект: прирост на 18,7% против 9,1% у образца R, а через 72 часа на 43,6% против 12,8%. Различие между продуктами в эти сроки было значимым (p<0,001).

По экспрессии генов через 72 часа картина была похожей. Экспрессия гена коллагена I типа выросла на 11,6% под действием образца R, но этот прирост был статистически незначимым, и на 22,9% под действием образца S, что было значимо (p<0,01). Экспрессия гена эластина выросла на 17,0% с образцом R (незначимо) и на 34,0% с образцом S (p<0,01). Прямые различия между продуктами по генам описаны как численные, без отдельной статистической проверки.

Электронная микроскопия показала, что оба продукта состоят в основном из сферических микрочастиц разного размера, хорошо очерченных, без заметной фрагментации и обломков. Поверхность частиц образца R была более неровной и микрогранулярной, с узелками и неоднородной текстурой, при большом увеличении на ней были видны выраженные микроучастки рельефа. Поверхность частиц образца S выглядела более гладкой и однородной при сохранении сферической формы.

Если сравнить динамику, видно, что разрыв между продуктами нарастал со временем: через 48 часов образец S превосходил образец R примерно вдвое по приросту активности, а через 72 часа уже более чем втрое. Это может означать, что при более длительном контакте различия стали бы ещё больше, но может быть и особенностью короткого эксперимента. Авторы прямо называют необходимыми более длительные исследования с оценкой белков, а не только генов.

Безопасность

Отдельного раздела о безопасности в работе нет. О биосовместимости авторы судят по тому, что оба продукта повышали, а не снижали метаболическую активность клеток. Тесты на цитотоксичность в узком смысле, оценку воспалительного и иммунного ответа и данные на живом организме авторы не проводили, поэтому о клинической безопасности из этой работы выводов сделать нельзя.

Как авторы объясняют результаты

Поскольку заявленный размер частиц у обоих продуктов одинаков, авторы сосредоточились на рельефе поверхности. Они предполагают, что топография поверхности частиц может влиять на прикрепление клеток, механотрансдукцию, то есть превращение механических сигналов в биохимические, и на реакцию матрикса при длительном контакте. Ранние ответы клеток на оба продукта совпадали, а различия проявились только при более длительном воздействии, что авторы трактуют как зависимость от конкретной формулы.

Результаты согласуются с прежними данными о том, что гидроксиапатит кальция стимулирует фибробласты и перестройку матрикса при прямом контакте частиц с клетками, и с сообщениями о различиях морфологии частиц между продуктами разных производителей. Однако авторы признают, что не проводили рентгенофазовый анализ и не могут подтвердить кристаллическую фазу гидроксиапатита, а связь между рельефом поверхности и биологическим ответом по данным микроскопии причинно установить нельзя.

Для сравнения, у разных производителей гидроксиапатит кальция может получаться разными технологическими способами, от которых зависят пористость, шероховатость и кристалличность частиц. Эти свойства известны в биоматериаловедении как факторы, влияющие на поведение клеток при контакте с керамикой, например в костной хирургии. Поэтому гипотеза авторов о роли рельефа поверхности выглядит правдоподобной, хотя в этой работе она не доказана.

Вопросы, которые задают пациенты

«Какой биостимулятор лучше?» Это исследование не отвечает на этот вопрос для клиники. Оно показало различия в реакции клеток в пробирке за трое суток, но не сравнивало результаты у людей. Выбор препарата зависит от зоны, задачи, толщины кожи и опыта врача с конкретным продуктом.

«Как быстро появится эффект биостимулятора?» По клиническим данным, которые обсуждаются в литературе, сразу после введения заметен объём геля-носителя, а прирост собственного коллагена развивается в течение нескольких месяцев. Лабораторные изменения экспрессии генов в первые 72 часа отражают самое начало этого процесса.

«Безопасен ли гидроксиапатит кальция?» Это хорошо изученный биосовместимый материал. В данной работе оба продукта не угнетали клетки, а повышали их активность. Клиническая безопасность определяется техникой введения, зоной и разведением, и эти вопросы исследование не затрагивает.

Ограничения

Оценивали только экспрессию генов, но не синтез белков, отложение матрикса и перестройку ткани. МТТ-тест показывает метаболическую активность, которая не равна делению клеток или синтезу коллагена. Использовали один тип клеток от одного донора, одну концентрацию и короткое время воздействия, до 72 часов. Иммунные и воспалительные показатели не оценивали, размер частиц не измеряли, микроскопия была только качественной. Двумерная культура клеток не воспроизводит сложность настоящей дермы.

Есть и конфликт интересов: один из авторов периодически консультирует компанию ILIKIA, которая дистрибутирует один из изученных продуктов (какой именно, в тексте не уточняется), второй автор работал в лаборатории Nucleo Vitro. Внешнего финансирования не было, для перевода и редактирования текста использовался ChatGPT.

Наконец, исследование сравнивало продукты в разведённом виде, без учёта того, как гель-носитель распределяется и рассасывается в тканях, а это тоже влияет на контакт частиц с клетками в реальной коже.

Что взять в практику

Главный вывод для практики касается того, что одинаковый состав на этикетке не гарантирует одинакового биологического поведения. Два биостимулятора с гидроксиапатитом кальция при одинаковом заявленном содержании и размере частиц по-разному влияли на активность фибробластов и экспрессию генов коллагена и эластина в лаборатории, и различались по рельефу поверхности частиц.

Однако переносить эти данные напрямую на клинику нельзя. Лабораторная культура клеток за 72 часа не отражает того, что происходит в коже за месяцы после инъекции, а прирост экспрессии генов не означает пропорционального прироста коллагена или видимого результата у пациента. Выбирать препарат по этой работе как по доказательству клинического превосходства не стоит, тем более с учётом связи одного из авторов с дистрибьютором.

Работа полезна как напоминание о том, что биостимуляторы разных производителей стоит рассматривать как разные продукты со своей доказательной базой. При выборе разумно опираться на клинические исследования конкретного препарата, его регистрационный статус и собственный опыт, а лабораторные сравнения воспринимать как гипотезы, требующие проверки на пациентах.

Для врача, работающего с биостимуляторами, работа также подсказывает, на что обращать внимание в материалах производителей: есть ли данные о морфологии частиц, о кристаллической фазе, о результатах на клетках и, главное, о клинических исследованиях с гистологией или ультразвуковой оценкой дермы. Чем полнее такая информация, тем увереннее можно прогнозировать поведение препарата в коже.

Термины

МТТ-тест

лабораторный метод оценки метаболической активности клеток по превращению красителя

Биостимулятор

инъекционный препарат, вызывающий синтез собственного коллагена в коже

Механотрансдукция

превращение клеткой механических сигналов от окружения в биохимический ответ