Ферментное и энергетическое разрушение сшитой гиалуроновой

Кратко

Эксперимент ex vivo на свиной коже с одним филлером: гиалуронидаза растворила около 88% геля, лазер Nd:YAG 1064 нм 57,3%, ультразвук и два других лазера лишь 3-5%; для клиники выводов нет.

Подробный обзор по полному тексту статьи · 9 мин чтения

Зачем понадобилось это исследование

Филлеры на основе сшитой гиалуроновой кислоты (ГК) остаются одними из самых частых процедур эстетической медицины. Авторы ссылаются на международный опрос ISAPS: число процедур с ГК-филлерами в мире выросло с 4 312 037 в 2022 году до 5 564 866 в 2023 году (по расчёту составителя, примерно на 29%). Чем больше инъекций, тем чаще встречаются осложнения и недовольство результатом, и тогда материал приходится удалять.

Удалить филлер сложнее, чем принято думать. Авторы приводят данные обзора 33 МРТ-исследований: сшитая ГК определялась в тканях у всех пациентов не менее двух лет, а в отдельных случаях до 15 лет. Длительное присутствие геля связывают с поздними осложнениями: смещением филлера, гранулёмами инородного тела, гиперчувствительностью замедленного типа и инфекциями, связанными с биоплёнкой.

Сегодня практически единственный широко применяемый способ растворить ГК-филлер это гиалуронидаза. У фермента есть ограничения, которые перечисляют авторы. Во-первых, он не различает введённую и собственную ГК кожи, поэтому избыточная доза может привести к потере объёма. Во-вторых, потребность в ферменте зависит от продукта и степени сшивки, а контролируемых данных по дозированию мало. В-третьих, это чужеродный белок, чаще животного происхождения: он может вызывать реакции гиперчувствительности, вплоть до редкой анафилаксии, а у людей, сенсибилизированных к яду перепончатокрылых, риск особенно высок.

Отсюда интерес к немеханическим способам. Раньше ультразвук и лазеры рассматривали в основном с точки зрения безопасности (как они влияют на филлер, если процедуры проводят рядом) либо в единичных клинических описаниях. По утверждению авторов, прямого сравнения фермента и нескольких энергетических методов на одном и том же сшитом филлере по единому аналитическому протоколу до сих пор не было. Эту задачу и решает работа.

Как был устроен эксперимент

Это контролируемое сравнительное лабораторное исследование на изолированной ткани (ex vivo). Использовали один коммерческий филлер Regenyal Idea: однофазный сшитый гель с общей концентрацией ГК 25 мг/мл, из которых около 8% приходится на свободную несшитую ГК. Брали одну производственную партию, чтобы исключить различия между сериями.

Моделью кожи служили шесть свежих свиных ушей из пищевого производства; их использовали в течение 24 часов после забоя. Иглой 27G в границу ретикулярной дермы и подкожной клетчатки на глубину примерно 2-3 мм вводили по 0,3 мл геля, после чего давали ему 30 минут «обжиться» в тканях. Каждое условие повторяли на трёх депо (биологический триплет), всего восемнадцать депо с интервалом не менее 1,5 см.

Шесть групп выглядели так: необработанный контроль; гиалуронидаза; микрофокусированный ультразвук (аппарат Ulthera, датчик 7 МГц, фокус на глубине 3 мм, 22 линии по 0,45 Дж, суммарно примерно 9,9 Дж, около 60 секунд); лазер Nd:YAG 1064 нм (импульс 150 мс, плотность энергии 120 Дж/см2, пятно 7 мм, 10 импульсов примерно с частотой 1 Гц, охлаждение эпидермиса криоспреем); диодный лазер 808 нм (25 Дж/см2, 25 мс, пятно 12 мм, 10 импульсов, контактное охлаждение); александритовый лазер 755 нм (25 Дж/см2, 20 мс, пятно 12 мм, 10 импульсов, охлаждение кожи). Все процедуры выполнял один оператор при комнатной температуре с фиксированными настройками внутри группы. После воздействия гель извлекали разрезом кожи и промывали фосфатным буфером.

Чем измеряли разрушение

Применили три метода. Инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье (FT-IR) показывает, сохраняются ли характерные химические группы ГК и полоса, связанная со сшивкой (около 1152 см-1). Термогравиметрический анализ (ТГА) отслеживает, как образец теряет массу при нагреве до 1000 °C в азоте со скоростью 10 °C в минуту: по температурам и потерям массы судят об устойчивости полимерной сети. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) с рефрактометрическим детектором определяла долю ГК, перешедшую в растворимую линейную форму и прошедшую через диализную мембрану при pH 7,4 и 37,5 °C за трёхдневный период.

Принципиально важно, что ВЭЖХ оценивает долю ГК, ставшей растворимой и низкомолекулярной, то есть даёт косвенное свидетельство разрыва цепей. Молекулярную массу напрямую не измеряли: гель-проникающая хроматография (SEC/GPC) в работу не вошла, и сами авторы называют это ограничением.

Для фермента схема была иной. Для количественного анализа 0,035 г бычьей тестикулярной гиалуронидазы (Hylase Dessau, 150 МЕ во флаконе) растворяли в 2 мл буфера, 1 мл геля смешивали с 2 мл раствора и помещали в диализную мембрану; контролем служил 1 мл геля в 2 мл буфера. Значения ВЭЖХ приведены как среднее со стандартным отклонением, а спектры ИК и кривые ТГА показаны как репрезентативные.

Что показали спектры и термогравиметрия

По данным FT-IR, во всех обработанных образцах сохранились полосы, типичные для ГК: алифатические группы CH2, карбоксилат COO-, гидроксильные группы и карбонильные колебания. Авторы делают вывод, что ни фермент, ни ультразвук, ни лазеры не разрушают химическую идентичность гиалуронана: меняется сеть и длина цепей, а не сами моносахаридные звенья. Ослабление и уширение полосы сшивки около 1152 см-1 они трактуют как возможную частичную потерю сшивки, но подчёркивают, что ATR-FT-IR не количественный метод для плотности сшивки, поэтому это лишь качественный признак.

В ТГА общая потеря массы к 1000 °C у необработанного геля составила 55,2%. У образца с гиалуронидазой она была ниже, 43,4%, и появилась дополнительная низкотемпературная ступень разложения (193-263 °C с потерей 18,3%); авторы связывают это с образованием коротких фрагментов и более высокой долей термически стабильного остатка. У физически обработанных образцов потеря массы была больше: 82,5% после ультразвука, 88,1% после Nd:YAG, 90,1% после диодного лазера и 94,9% после александритового. По мнению авторов, это отражает сниженную термическую устойчивость из-за нарушения сшитой сети.

Здесь есть оговорка, которую авторы разбирают сами. Александритовый образец оказался наименее термостабильным по ТГА, но при этом в ВЭЖХ почти не дал растворимой ГК. ТГА описывает, как распадается остаток при нагреве, и может реагировать на изменения сети, не связанные с высвобождением цепей. Поэтому термическую устойчивость одну нельзя считать надёжным заменителем реального растворения геля.

Главный результат: сколько ГК перешло в раствор

По ВЭЖХ три из четырёх энергетических условий почти не разрушили гель: микрофокусированный ультразвук дал 3,2 ± 1,1%, диодный лазер 3,2 ± 1,2%, александритовый лазер 5,3 ± 2,0%. Лазер Nd:YAG 1064 нм выделился на их фоне: 57,3 ± 5,2%.

Гиалуронидаза за первые сутки обеспечила 58,2 ± 2,9%, к концу вторых суток 87,8 ± 0,5% и на третьи сутки 88,1 ± 0,9%, то есть вышла на плато. Разница между Nd:YAG и ферментом за сутки составляет 0,9 процентного пункта (по расчёту составителя), и авторы называют эти значения близкими. При этом по итоговому уровню (около 88%) фермент остаётся самым полным методом; доля Nd:YAG от этого плато составляет примерно 65% (по расчёту составителя).

Сопоставление требует осторожности. Из текста не ясно, на какой срок наблюдения приходятся значения для лазеров и ультразвука, а протоколы подготовки образцов для фермента и энергетических методов различались (смешивание геля с раствором фермента против извлечения обработанного геля из тканей). Статистические тесты на сравнение групп в описании методов не названы, поэтому слова «сопоставимо» следует понимать как совпадение средних значений, а не как доказанную эквивалентность.

Почему сработал именно 1064 нм

Объяснение авторов основано на физике поглощения. Филлер на примерно 90% состоит из воды, поэтому при фототермическом воздействии основным поглотителем внутри депо служит вода, а не меланин или гемоглобин. Поглощение воды заметно растёт после примерно 950 нм, и свет 1064 нм поглощается водой, по их оценке, примерно на порядок сильнее, чем 755-808 нм. Одновременно 1064 нм слабее рассеивается и плохо поглощается эпидермальным меланином, поэтому достигает мишени на глубине 2-3 мм. Александритовый и диодный лазеры рассчитаны на поглощение меланином и энергию в основном отдают поверхностным слоям.

К этому добавляется длительный импульс 150 мс: он даёт объёмный нагрев, а не краткий микросекундный. Авторы считают, что именно такое условие вероятнее всего поднимает температуру депо выше диапазона 56-90 °C, в котором сшитая ГК теряет термическую стабильность. Температуру внутри ткани в эксперименте не измеряли, поэтому механизм остаётся предположением, хотя авторы считают его хорошо обоснованным.

Отрицательный результат ультразвука авторы объясняют параметрами: в литературе эффективная ультразвуковая деполимеризация ГК описана для высокомолекулярного вещества в разбавленном растворе, при длительном воздействии и часто с добавлением перекиси водорода или ионов металлов. Клинический аппарат с частотой 7 МГц даёт короткие сфокусированные импульсы в плотном геле. Следовательно, речь идёт о результате при данных настройках, а не об общем свойстве ультразвука.

Что это значит и чего нельзя утверждать

Авторы не предлагают заменить гиалуронидазу. Фермент оказался и полнее, и быстрее, и по-прежнему необходим при экстренных состояниях вроде сосудистой окклюзии. Интерес к лазерному подходу они видят в ситуациях, где фермент неудобен: при подтверждённой гиперчувствительности к нему или при желании пространственно контролируемо уменьшить небольшой поверхностный узел без диффузного разрушения собственной ГК. Они также предлагают проверить комбинацию, когда умеренный лазерный нагрев готовит плотный болюс, а меньшая доза фермента завершает работу; это лишь гипотеза для будущих исследований.

Главная проблема переноса в практику: тот же объёмный нагрев водосодержащей мишени неселективен. В живой ткани тепло разделят окружающие дерма и подкожная клетчатка, поэтому возможны термическое повреждение, рубцы и нарушения пигментации. Останется ли «терапевтическое окно» между разрушением геля и повреждением тканей, на этой модели не проверить. Отметим и то, что единичные клинические сообщения, на которые ссылаются авторы, касаются лазера 1444 нм при гранулёмах, а не 1064 нм.

Работа не даёт оснований использовать лазеры или ультразвук для растворения филлеров у пациентов и не подтверждает безопасность описанных настроек для живой кожи. Она показывает лабораторное различие между длинами волн на одном геле и формулирует гипотезы для следующих этапов.

Ограничения и расхождения в тексте

Основные ограничения перечислены самими авторами. Модель ex vivo, без кровотока, лимфатического оттока, воспалительного и ферментного ответа организма. Исследован один филлер с одной химией сшивки, поэтому порядок методов может измениться для более или менее сшитых продуктов. Использованы косвенные физико-химические показатели, а не клинические или гистологические. Внутритканевую температуру не фиксировали, молекулярную массу не определяли (нет SEC/GPC, нет ДСК). Повторностей мало (n = 3), все воздействия выполнял один оператор, поэтому абсолютные проценты авторы просят считать ориентировочными.

Внимательное чтение выявило несколько несоответствий внутри статьи. В таблице 1 для лазера Nd:YAG указаны интервалы первой ступени 196-283 °C и третьей 725-871 °C, тогда как в тексте 220-275 °C и 725-887 °C. Для контрольного образца таблица даёт начало второй ступени при 868 °C, текст при 869 °C. В методах сказано, что в каждое ухо вводили 0,3 мл геля, а депо всего восемнадцать на шести ушах, то есть по три на ухо; как распределялся объём между депо, не уточнено. Для количественной ВЭЖХ фермента использовали 1 мл геля, а не депо из тканей. Образец называют то HA-idea, то HA-standard. Данные, по заявлению авторов, доступны по запросу; финансирование: грант Медицинского университета Силезии, конфликт интересов не заявлен.

Термины

Сшитая гиалуроновая кислота: Гиалуроновая кислота, цепи которой химически соединены между собой в сетку; такой гель держится в тканях дольше, чем несшитая ГК, и применяется как филлер.
Гиалуронидаза: Фермент, который разрывает гликозидные связи цепи гиалуроновой кислоты; используется для растворения ГК-филлеров, в том числе при сосудистых осложнениях.
Исследование ex vivo: Эксперимент на изолированной ткани вне организма. Здесь использованы свиные уши; в них нет кровотока и иммунного ответа, поэтому результат нельзя напрямую переносить на пациента.
Фототермическое воздействие: Механизм, при котором поглощённая световая энергия превращается в тепло. В филлере основным поглотителем считают воду.
Nd:YAG лазер 1064 нм: Твердотельный лазер с длиной волны 1064 нм, свет которого слабо поглощается меланином и глубоко проникает в ткань; в работе использовали импульс 150 мс.
Микрофокусированный ультразвук: Метод, при котором ультразвуковая энергия собирается в небольшой точке на заданной глубине и нагревает её; применяется в аппаратах для подтяжки кожи, в работе использован Ulthera 7 МГц.
ВЭЖХ (HPLC): Хроматографический метод разделения и количественного определения веществ; здесь им измеряли долю ГК, перешедшую в растворимую линейную форму.
Термогравиметрический анализ (ТГА): Метод, в котором образец нагревают и записывают потерю массы; по температурам разложения судят об устойчивости полимера.
FT-IR спектроскопия: Метод инфракрасной спектроскопии, по которому определяют наличие характерных химических групп в веществе.
SEC/GPC: Гель-проникающая хроматография, позволяющая напрямую определить распределение молекулярной массы полимера; в этой работе не применялась.